PHBV改性及其作为软骨组织工程支架的研究

【摘要】第一部分生物玻璃复合PHBV制备PHBV/BG支架目的：将亲水性材料-生物玻璃（bioactiveglass，BG）与聚（羟基丁酸酯-羟基戊酸酯）（poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)，PHBV）混合制备PHBV/BG复合材料，评价复合材料的亲水性、生物相容性及多孔支架材料的物理特征。方法：采用“剂浇铸-粒子析出法”将一定量（10％和20％质量百分比）的生物玻璃与PHBV混合后制备PHBV/10％BG和PHBV/20％BG三维多孔支架材料及片状材料，通过静态水接触角法和吸水率检测并比较单纯PHBV及PHBV/生物玻璃复合材料的亲水性；通过细胞粘附率检测及扫描电镜观察细胞在支架材料的生长情况评价支架的生物相容性。扫描电镜观察PHBV及PHBV/生物玻璃支架多孔结构并检测材料的弹性模量。结果：PHBV分别与10%BG和20％BG复合后，复合材料的孔径、孔隙率与单纯PHBV相比无明显差异。水接触角从65±1.3°降低至52±2.5°和32±1.5°，弹性模量从0.16±0.03MPa增加到0.22±0.09MPa、0.41±0.09MPa，差异均有统计学意义(P＜0.01)。与单纯PHBV相比，细胞在复合材料上的粘附率明显提高，并随着复合材料中BG含量的增加而增加。扫描电镜观察示细胞在支架上粘附良好。结论：BG与PHBV复合可以改善PHBV材料的的亲水性，提高材料对细胞的粘附能力及力学性能。PHBV/BG复合支架具有良好的生物相容性和多孔支架结构。第二部分PHBV/BG复合软骨细胞构建组织工程化软骨目的：将软骨细胞接种到PHBV和PHBV/20％BG和支架上，体外培养后植入裸鼠皮下培养，观察期体内成软骨能力，评价PHBV/20％BG作为软骨组织工程支架材料的可行性。方法：将荧光标记的软骨细胞分别接种至PHBV和PHBV/20％BG支架上，培养4h和12h后荧光显微镜观察细胞在支架上的分布情况。将PHBV和PHBV/20％BG制成浸提液培养软骨细胞，并行CCK检测细胞增殖情况。将软骨细胞接种到PHBV和PHBV/20％BG支架上分别作为对照组和实验组，体外培养1周、2周、3周后行软骨细胞DNA定量检测。将体外培养3周的细胞－支架复合物移植到裸鼠皮下继续培养，至4周，8周，12周取材行组织学染色，细胞外基质成分（胶原、GAG）定量检测及弹性模量测定。结果：荧光显微镜观察显示与PHBV支架相比，软骨细胞接种至PHBV/20％BG支架后向支架内部迁徙的速度更快，在支架内部分布的更为均匀。CCK检测显示经PHBV/20％BG浸提液培养的软骨细胞增殖速度更快。体外培养期间，实验组新生组织软骨细胞DNA含量较对照组明显更多，且实验组裸鼠皮下培养新生组织在支架内分布更为均匀，厚度更厚，软骨结构更为成熟，且细胞外基质成分（胶原、GAG）含量和弹性模量更高。结论：BG与PHBV复合有利于软骨细胞在支架内均匀分布及增殖，与PHBV相比，以PHBV/20％BG为支架构建的组织工程化软骨质量更好。第三部分骨髓间充质干细胞的诱导分化以及与软骨细胞隔离共培养目的：体外分离培养骨髓间充质干细胞（bonemarrowstemcells，BMSCs）并通过添加诱导剂或与软骨细胞隔离共培养两种方式，诱导BMSCs向软骨细胞分化。方法：抽取兔髂骨骨髓后采用密度梯度离心法分离培养BMSCs并在光镜下观察，采用抗兔CD29、CD105、CD166单克隆抗体行流式细胞仪检测鉴定。取原代及传代BMSCs贴壁培养，采用CCK检测细胞增殖并绘制生长曲线。使用软骨细胞诱导剂、成骨诱导剂量及脂肪诱导剂诱导BMSCs三相分化，并行相应的组织学染色及RT－PCR检测。将BMSCs与PLA/PGA支架复合后置于transwell室内，分别放于含有DMEM培养液（对照组）和贴壁软骨细胞（实验组）的培养皿内培养8周，植入裸鼠皮下继续培养6周，行RT-PCR检测和组织学染色。结果：骨髓采用密度梯度离心法分离获得细胞，第2代细胞CD29、CD105、CD166的阳性率分别为为70%±10%、77%±8%、45%±8%。经软骨化、骨化及脂肪化诱导后，相应的特异性染色均呈阳性，RT－PCR检测分别有Ⅱ型胶原、Ⅰ型胶原及aP2基因的表达。BMSCs－支架复合物与软骨细胞体外隔离共培养后有新生软骨样组织形成，RT-PCR检测显示基质含有Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。裸鼠皮下培养6周后实验组可以形成良好的软骨样组织，组织学染色示新生组织有软骨陷窝结构，基质富含GAG和Ⅱ型胶原，对照组新生组织皱缩，无软骨样组织形成。结论：密度梯度离心法可以获得纯度较好的BMSCs，添加软骨化诱导剂及与软骨细胞隔离共培养的方式均能够诱导BMSCs向软骨细胞分化。第四部分PHBV/BG复合BMSCs修复兔关节软骨缺损的实验研究目的：研究PHBV/20％BG支架复合BMSCs修复兔膝关节软骨缺损的效果，探讨PHBV/20％BG作为软骨组织工程支架的可行性。方法：分离培养兔自体BMSCs后接种至PHBV/20％BG支架体外培养3天。将20只健康新西兰大白兔的20个膝关节随机分为A组、B组、C组，每组10个膝关节（B组和C组共用1个关节）。于股骨髁关节面非负重区制作软骨缺损模型，缺损直径5mm、深度3mm。A组植入BMSCs-PHBV/20%BG复合物，B组关节缺损处植入PHBV/20％BG支架，C组为空白组不作处理。术后12周观察软骨缺损区的修复情况，缺损区组织分别取材行组织学染色和Ⅱ型胶原PCR检测。结果：A组关节软骨缺损区被新生软骨样组织填充修复，关节面基本平整，并与周围软骨组织整合良好。组织学染色及PCR检测示新生组织有软骨陷窝形成，细胞外基质为GAG和Ⅱ型胶原。B组和C组软骨缺损未被修复，软骨缺损处为纤维组织填充。结论：PHBV/20％BG支架复合BMSCs后移植至关节软骨缺损区有新生软骨形成，软骨缺损修复良好，PHBV/20％BG支架可以作为软骨组织工程支架材料。
【作者】吴俊；
【导师】孙俊英；
【作者基本信息】苏州大学，骨外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】聚(羟基丁酸酯-羟基戊酸酯)；生物玻璃；亲水性；PHBV；软骨组织；骨髓间充质干细胞；生长因子；共培养；组织工程；

【参考文献】
[1]罗丹.基于CRM与数据挖掘的客户分类研究[D].辽宁工程技术大学,2005.
[2]万颖.北京市门头沟区社区商业发展问题及对策研究[D].北京交通大学,2014.
[3]易天舒,赵瑞雪,赵鹏举.数字环境下个性化信息服务研究[J].农业图书情报学刊,2005,12:43-46.
[4]朱文莉.企业并购交易定价问题研究[D].北京交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[5]郑振.维生素D对育龄健康女性血清8-异前列腺素F_(2α)和总抗氧化能力影响的探讨[D].遵义医学院,内分泌,2013,硕士.
[6]王甲云.分布式高校农业科技资源集成系统研究[D].中国农业大学,农业机械化工程,2004,硕士.
[7]秦炎生.GA移动企业文化建设体系研究[D].电子科技大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[8]陈学华,贺振华,赵岩,钟文丽.叠前分角度道集的瞬时谱差异信息提取及应用[J].石油地球物理勘探,2012,01:89-94+188+195-196.
[9]苟吉祥.基于多尺度纹理特征的性别识别技术的研究[D].兰州大学,电路与系统,2013,硕士.
[10]田文静.经方辨治糖尿病及并发症的临床证治规律研究[D].湖北中医药大学,中医临床基础,2013,硕士.
[11]龚文俊.西和县西山Ⅲ号滑坡稳定性分析[D].中国地震局兰州地震研究所,构造地质学,2012,硕士.
[12]田建伟,胡兆光,周景宏,肖潇,吴俊勇.考虑需求方响应资源的智能输电网扩展规划[J].电力系统自动化,2012,10:45-50.
[13]刘云华.浅谈建筑幕墙施工中的质量问题与控制方法[J].门窗,2015,01:2.
[14]刘静.自生动态膜生物反应器的模型研究[D].山东大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[15]李明菲.地震作用对路基上列车运行安全性影响研究[D].北京交通大学,2014.
[16]林钢锋.投资者情绪与期货市场收益关系的实证研究[D].浙江工业大学,技术经济及管理,2012,硕士.
[17]赵瑞香.我国电视真人秀节目研究[D].山东大学,艺术学,2013,硕士.
[18]李海涛.商业银行利率风险管理研究[D].西北工业大学,系统工程,2004,硕士.
[19]宣丹萍.浙江省人口年龄结构预测研究[D].杭州电子科技大学,统计学,2013,硕士.
[20]彭娜.论共同但有区别责任原则在国际气候环境法治中的实施[D].湖南师范大学,环境与资源保护法,2014,硕士.
[21]王凯.产品造型风格意象认知的研究[D].浙江大学,设计艺术学,2004,硕士.
[22]秦敏.信息技术在创建学习型组织中的应用研究[D].江西师范大学,2003.
[23]倪凯.旋转反光镜式分布光度测试及实时监控系统的研究[D].浙江大学,光学工程,2004,硕士.
[24]王世强.枕骨大孔区脑膜瘤的显微外科治疗[D].吉林大学,外科学,2013,硕士.
[25]张源凌.大连空港物流产业对城市经济贡献度研究[D].大连海事大学,物流工程,2014,硕士.
[26]余宁.重组鸡IL-18复合免疫增强剂对新城疫疫苗免疫增强作用的研究[D].河南科技大学,兽医（专业学位）,2013,硕士.
[27]朱宗霞.论我国民事保全制度之完善[D].对外经济贸易大学,民商法学,2004,硕士.
[28]杨宇龙.社会主义核心价值体系引领高校校园文化建设研究[D].河北师范大学,马克思主义基本原理,2012,硕士.
[29]刘帆.银行计算机系统安全运行规范研究[D].四川大学,电子与通信工程,2003,硕士.
[30]邢善芳.东部三大经济区域产业发展水平评价研究[D].合肥工业大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[31]孙渊.铜基大块非晶复合材料的制备及力学性能研究[D].兰州理工大学,材料学,2013,硕士.
[32]李惠莹.项目化教学的设计与应用研究[D].沈阳师范大学,教育技术学,2014,硕士.
[33]黄丹.幼儿园体育游戏中教师指导策略的个案研究[D].西南大学,学前教育学,2014,硕士.
[34]刘丽.我国商业银行经营管理突变评价研究[D].山东财经大学,金融学,2014,硕士.
[35]贾振宇.SMR-FBAR布拉格反射栅复合薄膜结构的制备及器件热性能研究[D].哈尔滨工业大学,材料学,2013,硕士.
[36]赵公怡.单处理器环境下实时调度算法研究[D].湖南大学,计算机科学与技术,2011,硕士.
[37]田芳.还脑益聪方对快速老化小鼠氧化应激和炎症反应的影响[D].北京中医药大学,中医学,2013,硕士.
[38]毕见广,董新洲,周双喜.基于两相电流行波的接地选线方法[J].电力系统自动化,2005,03:17-20+50.
[39]杨浩,白永飞,李永宏,韩兴国.内蒙古典型草原物种组成和群落结构对长期放牧的响应[J].植物生态学报,2009,03:499-507.
[40]张云江.政府面对网络媒体冲击的困境分析与对策研究[D].云南大学,公共管理,2012,硕士.
[41]李彦龙.HITPERM纳米合金结构及结构缺陷的正电子湮没寿命研究[D].东北大学,材料物理与化学,2011,硕士.
[42]韩华.棉纤维成熟度及截面形态特征测试方法研究[D].西安工程大学,纺织工程,2013,硕士.
[43]贾楠.超高速OTDM光通信系统关键技术研究[D].北京交通大学,2014.
[44]徐庆华.工程项目承包商施工阶段主体行为风险管理研究[D].天津大学,水利工程,2013,硕士.
[45]贾文涛.Cu_(45)Zr_(46)Al_7Ti_2金属玻璃压缩变形中剪切带的分布及密度变化[D].兰州大学,材料物理与化学,2014,硕士.
[46]李英.日本高等教育大众化研究[D].河北大学,比较教育学,2003,硕士.
[47]倪博溢,萧德云.非均匀采样系统的一种递推辨识方法[J].自动化学报,2009,12:1520-1527.
[48]李欣然,郭希铮,王德伟,郝瑞祥,游小杰.基于LCL滤波的大功率三相电压型PWM整流器[J].电工技术学报,2011,08:79-84.
[49]高慧祯.BGP、P1NP和β-CTx与2型糖尿病的相关性研究[D].郑州大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[50]张峰,洪津.数据仓库技术在设备管理决策支持系统中的应用[J].设备管理与维修,2005,06:8-10.